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2020-02-25 10:41:44

新冠肺炎 | # PCR實(shí)驗(yàn)室是如何將新冠病毒檢測出來的? #

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新型冠狀病毒肺炎

新型冠狀病毒肺炎又稱“2019-nCoV“,是2019年在人體中發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒新毒株,起源于武漢。該病毒癥狀一般為發(fā)熱、乏力、干咳、逐漸出現(xiàn)呼吸困難。你知道新冠病毒是如何檢測的嗎?

新冠病毒的檢測

01、認(rèn)識(shí)冠狀病毒

冠狀病毒是一個(gè)大型病毒家族,因該病毒形態(tài)在電鏡下觀察類似王冠而得名。目前為止發(fā)現(xiàn),冠狀病毒僅感染脊椎動(dòng)物,可引起人和動(dòng)物呼吸道、消化道和神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如感冒以及中東呼吸綜合征(MERS)和嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)等較嚴(yán)重疾病。

眾所周知,新型冠狀病毒潛伏期為14天,當(dāng)出現(xiàn)呼吸困難、乏力、高燒等現(xiàn)象,應(yīng)當(dāng)盡早報(bào)備相關(guān)機(jī)構(gòu),盡早提取標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)篩查。相信大家都很好奇,新冠病毒是如何被檢測出來的呢?

02、新冠病毒核酸檢測流程

采取咽拭子樣本,送到檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)會(huì)為核酸檢測準(zhǔn)備4個(gè)區(qū)域,分別是試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

其中試劑準(zhǔn)備區(qū)負(fù)責(zé)接收患者樣本,樣本準(zhǔn)備區(qū)則負(fù)責(zé)進(jìn)行對樣本的核酸進(jìn)行提取,擴(kuò)增區(qū)則是擴(kuò)增復(fù)制核酸樣本,擴(kuò)增后分析區(qū)就是分析樣本內(nèi)核酸能能否與標(biāo)準(zhǔn)樣配對,通過儀器檢測的到,就判斷成陽性,如果檢測不到就是陰性。

03、認(rèn)識(shí)PCR實(shí)驗(yàn)室

PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室,是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于放大特定的DNA片段,可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng),能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量,其精確度高達(dá)納米級(jí)別,精確檢測新型冠狀病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強(qiáng)、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時(shí)判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗(yàn)依據(jù)。

PCR實(shí)驗(yàn)室分類:普通PCR實(shí)驗(yàn)室、全自動(dòng)定量PCR實(shí)驗(yàn)室、一體自動(dòng)化分析PCR實(shí)驗(yàn)室。

04、PCR實(shí)驗(yàn)室的四個(gè)分區(qū)

01、試劑準(zhǔn)備區(qū)

功能作用:試劑準(zhǔn)備區(qū)是PCR實(shí)驗(yàn)室中最為“潔凈”的區(qū)域,它不應(yīng)有任何核酸成分的存在,否則將嚴(yán)重影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。標(biāo)本的制備應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

主要設(shè)備:冰箱、低溫冰箱、混勻器、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動(dòng)紫外燈。

試劑制備

02、樣本準(zhǔn)備區(qū)

功能作用:核酸提取、貯存,擴(kuò)增反應(yīng)管制作。

主要設(shè)備:冰箱、超低溫冰箱、高速冷凍離心機(jī)、混勻器、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動(dòng)紫外燈、水浴鍋、生物安全柜。

03、擴(kuò)增區(qū)

功能作用:擴(kuò)增反應(yīng)體系的配置和核酸的提取加入要在擴(kuò)增區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

主要設(shè)備:擴(kuò)增儀、離心機(jī)、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動(dòng)紫外燈。

生物安全柜內(nèi)操作

04、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

功能作用:產(chǎn)物分析區(qū)最后一個(gè)工作區(qū)域,用于擴(kuò)增片段的分析,由于本工作區(qū)域應(yīng)設(shè)置為負(fù)壓狀態(tài),空氣流向?yàn)橛赏庀騼?nèi),以防止擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠的流出(一般四個(gè)分區(qū)皆設(shè)置緩沖間)。

主要設(shè)備:凝膠成像分析儀、電泳儀、電泳槽、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動(dòng)紫外燈。

即:試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本準(zhǔn)備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

PCR 實(shí)驗(yàn)室的各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域之間應(yīng)形成單向工藝流、物流、人流與氣流,實(shí)現(xiàn)單向流程的屏障保護(hù)。通過嚴(yán)格的單向流線,避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾和交叉污染,防止核酸氣溶膠對實(shí)驗(yàn)過程造成污染,產(chǎn)生假性結(jié)果。

避免交叉感染

PCR實(shí)驗(yàn)室的氣流壓差原理及控制:

1、試劑準(zhǔn)備區(qū)是工藝流線的開始,設(shè)計(jì)為正壓或常壓,避免外界環(huán)境的污染。

2、樣品準(zhǔn)備區(qū)一般為常壓或負(fù)壓,大多數(shù)情況下設(shè)計(jì)成二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室,避免實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物溢出,污染外界環(huán)境。

3、擴(kuò)增區(qū)為負(fù)壓,避免實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物溢出,污染外界環(huán)境。

4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源,通常壓力設(shè)計(jì)為最低,避免實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物溢出,污染外界環(huán)境。

供參考

05、PCR實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)

PCR實(shí)驗(yàn)室的送排風(fēng)設(shè)計(jì)及排放準(zhǔn)則:

1、氣流組織宜采用上送下排;

2、生物安全柜上方不得設(shè)計(jì)送風(fēng)口;

3、高效過濾排風(fēng)口應(yīng)設(shè)計(jì)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)污染最嚴(yán)重的區(qū)域,且為單向;

4、不得循環(huán)送排風(fēng)。

PCR實(shí)驗(yàn)室排風(fēng)應(yīng)有效處理達(dá)標(biāo)后在2m以上高空進(jìn)行排放。

怎么定義為陽性?

20世紀(jì)70年代以來,國際上統(tǒng)一了冠狀病毒的命名,了解了病毒的基因結(jié)構(gòu)和部分功能,研究出好幾種可識(shí)別病毒生長的指標(biāo),只有定下指標(biāo),才能檢測你是陽性陰性。

那么“新冠病毒”是怎么被定義為陽性的?

“新冠病毒陽性”要確認(rèn)這一點(diǎn),必須從樣本(比如痰、汗液、血液、糞便等等)里提取出完整的病毒。在這次疫情暴發(fā)之初,我們有聽到一些新聞所謂“分離出病毒株”,大概指的就是這個(gè)。

這個(gè)操作挺麻煩的,并且不是每一次都能分離成功。只能作為“確實(shí)有病毒在這里”的絕對證據(jù)。但作為給患者的檢測,既慢,又不夠準(zhǔn)確。因此,現(xiàn)在我們聽到更多的,是“新冠病毒核酸檢測陽性”。

所謂“新冠病毒核酸檢測陽性”,又是怎么來的呢? 首先,提取樣本。就是把痰啊、咽拭子采到的東西啊、糞便啊等等,先想辦法收起來,拿到實(shí)驗(yàn)室把樣本里面的核酸(就新冠病毒而言,指RNA)提取出來。RNA提取之后,降解速度非常快。因此,其實(shí)我們需要把RNA再對應(yīng)的轉(zhuǎn)成為cDNA。

接下來的過程,本質(zhì)叫做PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。大致意思就是用特別的標(biāo)簽,把新冠病毒最特征的那一段信息(原本是RNA信息,此時(shí)已經(jīng)對應(yīng)轉(zhuǎn)換成為cDNA信息)給識(shí)別出來。不只是識(shí)別,這個(gè)過程是在識(shí)別的基礎(chǔ)上,反復(fù)的復(fù)制這一段。那么經(jīng)過一段時(shí)間,原來在樣本里只有一點(diǎn)點(diǎn)的信息,就被擴(kuò)增到很多了,也就容易查到了。

檢測用到的,叫做realtimePCR。啥意思呢?就是說病毒的核酸信息每一次被復(fù)制都會(huì)被記錄下來。這樣檢測更準(zhǔn)確。并且,理論上說,甚至可以推斷出樣本里面的病毒核酸的密度。

如果樣本里面沒有病毒核酸,那么那個(gè)尋找病毒信息的標(biāo)簽,就永遠(yuǎn)也找不到落點(diǎn)。這時(shí)候當(dāng)然不可能有任何東西被復(fù)制出來,那么檢測結(jié)果就是陰性。

如果樣本里面有病毒核酸,那么標(biāo)簽就可以找到它,并且復(fù)制它,然后發(fā)出信號(hào)告訴檢測者:這里有病毒。這,就是核酸檢測陽性。

然而,當(dāng)樣本里的病毒核酸數(shù)量特別少的時(shí)候,標(biāo)簽可能找不到……這就會(huì)造成檢測的假陰性。

如果標(biāo)簽的靈敏度不夠,也會(huì)出現(xiàn)找不到病毒核酸的情況。這也會(huì)造成檢測的假陰性。 某些患者檢測若干次都是陰性,最后才發(fā)現(xiàn)是陽性,

簡單來說,就是有可能是取樣的時(shí)候沒有取到病毒最多的地方,或者當(dāng)時(shí)患者體內(nèi)的病毒確實(shí)不多,或者檢測的試劑靈敏度不夠。

當(dāng)然,還有其他諸如環(huán)境因素、儀器問題等等的原因。要知道,任何檢測手段都是有局限的,偶爾的例外并不是稀罕事。另外,因?yàn)槟壳皩τ谛鹿诘牧私獠坏轿?,檢測不能一步到位,這也確實(shí)是現(xiàn)實(shí)。

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